重组腺病毒介导的FAT10基因RNA干扰抑制肝细胞癌生长的实验研究

【摘要】研究背景和目的:原发性肝癌超过90％为肝细胞癌，是发病率世界排名第五位的恶性肿瘤，造成每年近100万例患者死亡。尽管近年来肝细胞癌(HCC)的诊断和治疗取得了长足的进步，但由于对肿瘤的确切生物学的了解甚少限制了患者的预后。从诊断到发病仅有平均约6至9个月的预期寿命。目前，手术仍是肝癌治疗的主要选择。然而，由于手术切除后的高复发率，肝癌手术后的长期预后仍然不能令人满意。为了解决这个问题，目前，大量的关于肝细胞癌的生物疗法进行了研究，并取得了一定的成果。泛素－蛋白酶体途径是细胞内蛋白质的靶向降解的主要机制。研究表明，泛素相关的家族成员也与细胞周期的调控以及细胞凋亡有关。FAT10，也被称为双泛素蛋白，其在细胞周期调控中的作用是通过与有丝分裂检查点蛋白-MAD2相互作用，可以通过降低定位在动粒上的MAD2从而增加染色体的不稳定性。已有研究表明，FAT10基因在多种恶性肿瘤中高表达，特别是在90％的肝细胞癌癌中FAT10呈过表达，提示其在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。在p53的损失和在长期体外培养的肝癌细胞中FAT10可以诱导染色体的不稳定性。然而，FAT10在肝细胞癌的确切功能尚不清楚，需要进一步的研究。基于以上原因，我们采用重组腺病毒介导的RNA干扰，在体内外研究沉默FAT10的表达后对肝细胞癌的体内外生物学效应，为进一步探讨FAT10在肝细胞癌发生发展中的作用机制奠定基础，为肝细胞癌的基因治疗提供理想策略。研究分为四部分进行：1.Ad-siRNA/FAT10重组腺病毒载体的构建与鉴定；2.Ad-siRNA/FAT10对Hep3B肝癌细胞FAT10基因及蛋白表达的影响3.siRNA沉默FAT10基因对Hep3B肝癌细胞在体外增殖、克隆形成、细胞周期及凋亡的影响；4.siRNA沉默FAT10基因对荷瘤小鼠肿瘤生长抑制及生存保护效应研究。主要方法1.实验动物和细胞培养6周龄裸鼠在实验动物中心饲养，所有动物实验均通过伦理委员会批准后执行。肝癌细胞Hep3B细胞培养Hep3B细胞培养基选用含10%FCS的DMEM低糖培养基，在温度为37°C、湿度95%，含5%CO2的细胞培养箱中培养。2.重组腺病毒载体pAd-siRNA/FAT10的构建与鉴定从GenBank中获得FAT10的互补DNA序列，在Ambion公司的网站设计工具在线设计并合成针对FAT10的siRNA序列，然后亚克隆穿梭质粒pDC315并测序，酶切线性化后，与腺病毒骨架质粒pBHG1oXE1,3Cre及DOTAP脂质体共培养进行同源重组，转染HEK293细胞,包装得到粗提腺病毒pAdsiRNA/FAT10。经过多轮氯化铯密度梯度纯化。标准空斑试验测定病毒液的滴度和感染效率，然后，FAT10的表达在mRNA和蛋白质水平通过RT-PCR和免疫印迹测定法(westernblot)进行检测。3.SiRNA沉默FAT10基因对Hep3B肝癌细胞的增殖、克隆形成、细胞周期及凋亡的影响(1)采用MTT比色测定法分别检测Hep3B细胞增殖情况。Hep3B细胞以5×103/孔接种于96孔板中，过夜培养。分别用Ad-siRNA/FAT10(1×109PFU)或对照组处理24小时，加MTT溶液(5mg/ml)培养48h，然后在A490处测定光密度(OD)值。细胞增殖抑制率(％)=1-(实验样品OD值/对照组OD值)×100％。(2)克隆形成测定时将3×102细胞接种于培养皿中，然后用Ad-siRNA/FAT10处理后培养18天，细胞集落用戊二醛固定，结晶紫染色后显微镜下手工计数。(3)采用流式细胞学方法进行细胞周期分析并检测Hep3B细胞的凋亡情况。细胞周期分析时贴壁细胞通过胰酶消化后用70％乙醇过夜固定，用PBS洗涤后RNA酶处理，加入50μg/mL的碘化丙啶和0.05％(v/v)的TritonX-100染色45分钟，流式细胞仪分析；凋亡分析时将细胞接种于100ml瓶培养直到有8085％汇合时收获细胞，用冰冷的PBS洗两次，再悬浮于结合缓冲液。加入AnnexinV（0.5mg/ml）和碘化丙啶PI（0.5mg/ml），避光染色15分钟通过流式细胞仪分析。4.SiRNA沉默FAT10基因对肝细胞癌荷瘤小鼠的体内效应研究6周龄裸鼠在实验动物中心饲养，所有动物实验研究都通过伦理委员会的批准后执行。通过左侧腋下注射1×105的Hep3B细胞构建荷瘤小鼠模型。两个星期后接种肿瘤细胞，荷瘤小鼠模型构建成功后选取30只小鼠随机分为三组(每组10只)，每组小鼠分别并接受瘤内注射Ad-siRNA/FAT10的(1×109PFU)、Ad-siRNA/LacZ(1×109PFU)和100μLPBS。每隔3天测量小鼠的肿瘤体积，随时观察小鼠成活情况。肿瘤体积测量公式为体积＝长度/2×宽度2。主要结果1.重组腺病毒载体pAd-siRNA/FAT10的构建与鉴定为了确定腺病毒介导的siRNA是否可用于特异性地抑制靶基因的表达，我们采用靶向FAT10的重组腺病毒Ad-siRNA/FAT10感染HCC细胞系。结果显示FAT10的表达在感染后48小时被抑制，然而，FAT10的表达在对照组中没有降低，且Ad-siRNA/FAT10不诱导非特异性的β-actin基因表达下调。此外，RT-PCR反应结果显示Ad-siRNA/FAT10可以明显降低FAT10mRNA表达水平，而对照组没有明显降低FAT10mRNA表达的效应。结果表明，Ad-siRNA/FAT10可以抑制肝癌细胞的FAT10表达。2.SiRNA沉默FAT10基因对Hep3B肝癌细胞的体外效应(1)Ad-siRNA/FAT10抑制肝癌细胞生长和克隆形成的效应。我们首先检测了Ad-siRNA/FAT10对肝癌细胞Hep3B细胞增殖的影响。通过MTT比色法测定其抑制率。然后观察Ad-siRNA/FAT10对细胞克隆形成的影响。结果表明，与对照组相比较，Ad-siRNA/FAT10不仅可以显著抑制Hep3B细胞的增殖而且降低了细胞的克隆形成。(2)Ad-siRNA/FAT10对肝癌细胞的体外增殖周期的影响此外，为了确定Ad-siRNA/FAT10是否可以改变Hep3B细胞的细胞周期分布，我们在病毒感染后96小时进行流式细胞分析。我们的结果显示与对照组相比，在Ad-siRNA/FAT10感染后的S期表现出细胞群降低。该数据表明，Ad-siRNA/FAT10通过抑制肝癌细胞的S-期从而对肝癌细胞生长显示出特定的抑制效应。(3)Ad-siRNA/FAT10对肝癌细胞凋亡的影响。为了检测Ad-siRNA/FAT10能否诱导肝癌细胞的凋亡，我们在Ad-siRNA/FAT10，Ad-siRNA/LacZ或PBS感染两天后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果表明，与对照组相比，Ad-siRNA/FAT10组Hep3B细胞的凋亡率明显增加，与对照组有显著性差异。说明Ad-siRNA/FAT10有诱导肝癌细胞的凋亡的潜力。3.SiRNA沉默FAT10基因对肝细胞癌的体内效应研究为了明确Ad-siRNA/FAT10是否可在体内抑制肝癌生长以及其对肝癌移植瘤动物模型生存周期的影响，我们建立了裸鼠肝癌移植瘤模型。实验分三组进行，接种Hep3B细胞两周后，分别瘤内注射Ad-siRNA/FAT10，Ad-siRNA/LacZ或PBS。并对肿瘤体积和裸鼠的生命周期进行观察。结果表明，与Ad-siRNA/LacZ及PBS组相比，Ad-siRNA/FAT10治疗组的肿瘤生长明显受到抑制。此外，Ad-siRNA/FAT10治疗组死亡裸鼠死亡均发生于治疗40天之后，然而，所有的对照组小鼠在40天内死亡。此外，Ad-siRNA/FAT10组裸鼠的平均寿命延长显著，其中约半数小鼠存活超过60天。总而言之，这些数据表明，重组腺病毒介导的靶向FAT10RNA干扰可以发挥体内强大的抗肿瘤效应，可以抑制肿瘤生长，延长荷瘤裸小鼠的生存期。结论在这项研究中，我们采用腺病毒介导的小干扰RNA(siRNA)技术来研究沉默FAT10的表达对肝癌细胞生长的体外和体外效应。结果显示，Ad-siRNA/FAT10通过降低肝癌细胞中FAT10表达，从而发挥如下效应：1.在体外可以抑制肝癌细胞生长和克隆形成；2.抑制肝癌细胞S期、诱导肝癌细胞的体外凋亡；3.在体内可以抑制肿瘤的生长并可以延长荷瘤小鼠的生命周期。我们的研究结果表明，重组腺病毒介导的FAT10RNA干扰可能成为一种肝细胞癌临床治疗的有效策略。
【作者】陈景祥；
【导师】陈平；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2014，博士
【关键词】FAT10；肝细胞癌；RNA干扰；重组腺病毒载体；基因治疗；

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